🔬 Детальний Протокол Експерименту: Генна Трансформація E. coli
Цей експеримент базується на стандартному протоколі хімічної трансформації з використанням навчального набору. Мета — ввести зовнішню ДНК (плазміду) у бактеріальну клітину E. coli.
Основні Компоненти:
Мікроорганізм: E. coli (лабораторний, непатогенний штам у ліофілізованій формі)
Генетичний Вектор: Плазміда, що містить ген GFP (Green Fluorescent Protein) — наш репортерний ген.
Реагент Компетентності: Розчин CaCl2 (Хлорид Кальцію).
* Селективне Середовище: Поживне середовище (агар LB), інше доповнене антибіотиком (Стрептоміцин і Канаміцин) для відбору лише тих клітин, які успішно трансформувалися (захопили плазміду).
CRISPR-Cas9 — це "молекулярні ножиці", а gRNA (guide RNA) — це "поводир", який направляє ножиці до конкретної ділянки ДНК для редагування геному.
K43 template - це термін специфічний генетичний шаблон або плазміда, що використовується для певного типу редагування або трансформації у нашій систему, вона вказує що саме, де і яким чином потрібно модифікувати.
Ключові Етапи Процедури:
1) Готуємо Агар
1. 7 Петрі з простим LB та 7 Петрі з антибіотиком - Стрептоміцином та Канаміцином - згодом вони стануть фільтрами які запобігатимуть росту небажаних немодифікованих чи контамінаційних організмів
2.Розведіть сухий Агар в 150 мл води —
Та підігрійте в мікрохвильовій але не доводьте до кипіння, збовтайте доти поки він не стане прозорим
3.Розлийте в чашки Петрі, почекайте поки охолодитися до кімнатної температури після чого можете помістити в холодильник
2) Відновлення ліофілізованих бактерій
1.Додайте до кожної з пробірок 100 мікролітпів стерильної води - тобто 0,1 мілілітра
2. Взбовтайте
3. Посійте ваші клітини на поживне середовище без антибіотика!!!
4. Помістіть в термостат або ще якимось чином підніміть температуру 30-37 градусів.
5. Інкубуйте 24-72 години до появи колоній
6. Перевід бактерії в більш активну фазу де вони зможуть прийняти ДНК
Для цього помістіть їх в рідке поживне середовище
7.Інкубуйте 8 годин при температурі 35-37°С
8. Іншу частину залишіть на чашці Петрі
9. Ваш родин повинен спати мутним
3) Підготовка до генного редагування
1. Помістіть пробірку в холодну воду 0-4°С на 5 хвилин
2. Відцентрифуйте розчин до появи осаду на дні пробірки
3. Розведіть cas9,gRNA,k43 template, GFP plasmid, Kan Plasmid в 55 мікролітрах води
4. Обмежено заберіть пепіткою поживний розчин
так ,щоб залишити осад на дні
5. Ресуспендуйте, тобто введіть 100 мікромілілтрів CaCl2 з метою зробити клітинну стінку проникною
6. Додайте E.Coli з чашки Петрі які не проходили відновлення в рідкому поживному середовищі
7. В цю ж пробірку додайте по 10 мікролітрів наших ДНК та РНК
4. Генне редагування
1. Інкубуйте пробірку при 0-4°С 30 хвилин ,щоб прикріпити ДНК,РНК та білки до клітинної стінки
2. 42°С 60 секунд - щоб створити пори та забезпечити проникнення ДНК всередину клітини.
3. Холод 2 хвилини ,щоб закрити пори та закріпити результат
4. Відновлення - додайте 250 мікролітрів поживного розчину
5. Інкубуйте 1 годину для відновлення мембрани та початку експресії нового гена (GFP та гена стійкості до антибіотика)
5. Посів та очікування результату
1. Клітини висійте на чашки Петрі з агаром, що містить антибіотик. Це дозволяє вижити лише трансформованим клітинам (які мають ген стійкості на плазміді) і знищує нетрансформовані чи контамінаційні організми
2. Інкубуйте при 30°С, ні в якому разі не інкубуйте при 37°С, білок Хромофор найбільш ефективний при 30°С
3. Очікуйте 36-72 години
4. Можете пересіяти та рознести рівномірно по всій чашці Петрі для досягнення ще більших колоній
Маркер Успіху: Світіння під УФ-світлом — це прямий доказ того, що ген GFP був успішно експресований. Він служить репортерним геном для відстеження та ізоляції клітин, які одночасно захопили іншу, "невидиму" цільову ДНК.
розгорнути опис
згорнути опис
